
上海有機(jī)所交叉中心開(kāi)發(fā)深覆蓋離子淌度質(zhì)譜流式單細(xì)胞代謝組學(xué)技術(shù)MetCell
單細(xì)胞代謝組學(xué)技術(shù)為揭示單細(xì)胞尺度的代謝多樣性與異質(zhì)性提供了關(guān)鍵手段。質(zhì)譜技術(shù)因具備高通量、無(wú)需標(biāo)記及覆蓋范圍廣等優(yōu)勢(shì),已成為代謝組學(xué)研究的核心分析平臺(tái),并逐步應(yīng)用于單細(xì)胞代謝組學(xué)研究。然而,受限于單細(xì)胞內(nèi)代謝物豐度極低,現(xiàn)有方法在檢測(cè)靈敏度、代謝物覆蓋度以及代謝物注釋準(zhǔn)確性等方面仍面臨顯著挑戰(zhàn)。單細(xì)胞中的代謝物通常處于阿摩爾(attomole)水平,接近質(zhì)譜檢測(cè)極限,導(dǎo)致信號(hào)強(qiáng)度微弱、信噪比普遍偏低。因此,現(xiàn)有單細(xì)胞代謝組學(xué)方法往往只能檢測(cè)少數(shù)高豐度代謝物或脂質(zhì)分子,其覆蓋深度遠(yuǎn)未達(dá)到組學(xué)研究的需求。同時(shí),技術(shù)噪聲的累積進(jìn)一步削弱了檢測(cè)靈敏度,造成大量缺失值,嚴(yán)重影響單細(xì)胞代謝物的準(zhǔn)確檢測(cè)與可靠定量。此外,由于單細(xì)胞樣本量有限且單細(xì)胞分析時(shí)間極短,代謝物離子難以獲得充分表征,現(xiàn)有方法在單細(xì)胞尺度下實(shí)現(xiàn)高置信度代謝物注釋仍然十分困難。這些在靈敏度、穩(wěn)健性、覆蓋度和準(zhǔn)確性方面的局限性,顯著制約了單細(xì)胞代謝組學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展與廣泛應(yīng)用。
近日,中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所生物與化學(xué)交叉研究中心朱正江研究員團(tuán)隊(duì)在Nature Methods雜志發(fā)表了題為“Deep-coverage single-cell metabolomics enabled by ion mobility-resolved mass cytometry”的研究論文(https://doi.org/10.1038/s41592-025-02970-2)。該研究的相關(guān)工作同時(shí)也被Nature Methods以Research Briefing形式進(jìn)行報(bào)道。該研究構(gòu)建了一套基于離子淌度質(zhì)譜流式的單細(xì)胞代謝組學(xué)分析平臺(tái),并系統(tǒng)發(fā)展了離子淌度選擇性富集(selective ion accumulation)與細(xì)胞信號(hào)疊加(cell superposition)策略,有效提升了小分子代謝物檢測(cè)的靈敏度與分析穩(wěn)健性。結(jié)合自主開(kāi)發(fā)的數(shù)據(jù)分析算法與軟件 MetCell,該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了兼具高通量、深覆蓋、超靈敏檢測(cè)與代謝物準(zhǔn)確注釋的單細(xì)胞代謝組學(xué)分析?;谠摲椒ǎ芯繄F(tuán)隊(duì)構(gòu)建了衰老小鼠原代肝臟細(xì)胞的單細(xì)胞代謝圖譜,實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞類型及亞型的精準(zhǔn)注釋,并系統(tǒng)揭示了衰老過(guò)程中肝細(xì)胞代謝狀態(tài)的變化及其顯著異質(zhì)性。

首先,研究團(tuán)隊(duì)搭建了一套基于離子淌度質(zhì)譜的流式分析裝置,用于高通量單細(xì)胞代謝組學(xué)分析(圖 1)。該裝置采用氣壓驅(qū)動(dòng)的流式細(xì)胞術(shù),將單個(gè)活細(xì)胞連續(xù)注入離子淌度質(zhì)譜系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)每分鐘約 25–40 個(gè)細(xì)胞的穩(wěn)定分析通量,并可持續(xù)穩(wěn)定進(jìn)樣數(shù)小時(shí)。借助離子淌度與質(zhì)譜的快速分離與檢測(cè),該技術(shù)能夠同步記錄單細(xì)胞內(nèi)代謝物的質(zhì)荷比(m/z)、碰撞截面積(CCS)及信號(hào)強(qiáng)度(intensity)。同時(shí),在相同實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)采集,實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞原位狀態(tài)下代謝物碎片信息的獲取,從而對(duì)單細(xì)胞內(nèi)代謝物離子進(jìn)行多維度、系統(tǒng)性的表征。
其次,為顯著提升小分子代謝物的檢測(cè)靈敏度,研究團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)發(fā)展了離子淌度選擇性富集策略。通過(guò)優(yōu)化離子淌度條件下離子的累積與釋放電壓等關(guān)鍵參數(shù),該策略使常見(jiàn)小分子代謝物的檢測(cè)靈敏度提升約 20 倍。針對(duì)單細(xì)胞代謝組學(xué)中普遍存在的信號(hào)信噪比低、檢測(cè)穩(wěn)健性不足以及缺失值比例高等技術(shù)瓶頸,研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步提出了細(xì)胞信號(hào)疊加策略。該策略首先對(duì)數(shù)百個(gè)細(xì)胞中同一代謝物對(duì)應(yīng)的離子信號(hào)進(jìn)行疊加,有效增強(qiáng)代謝物離子的信噪比與整體檢測(cè)靈敏度;隨后,在此基礎(chǔ)上對(duì)單個(gè)細(xì)胞的代謝物信號(hào)進(jìn)行靶向提取,在保持單細(xì)胞分辨率的同時(shí),實(shí)現(xiàn)代謝物離子的準(zhǔn)確檢測(cè)與可靠識(shí)別。通過(guò)該策略,峰檢測(cè)信噪比的中位數(shù)提高約 33 倍,平均缺失比例由 82% 顯著降低至 6%,數(shù)據(jù)質(zhì)量得到大幅提升。綜合離子淌度選擇性富集與細(xì)胞信號(hào)疊加兩種增敏策略,離子淌度質(zhì)譜流式分析實(shí)現(xiàn)了阿摩爾級(jí)檢測(cè)靈敏度,能夠?qū)蝹€(gè)細(xì)胞內(nèi)代謝物的動(dòng)態(tài)范圍進(jìn)行準(zhǔn)確表征。

圖 1.深覆蓋離子淌度質(zhì)譜流式單細(xì)胞代謝組學(xué)技術(shù)平臺(tái)圖
結(jié)合離子淌度質(zhì)譜流式單細(xì)胞代謝組分析的技術(shù)優(yōu)勢(shì),研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了面向該技術(shù)的自動(dòng)化高效數(shù)據(jù)處理算法和軟件MetCell(圖 2)。在對(duì) HepG2 細(xì)胞進(jìn)行 120 分鐘連續(xù)采集的數(shù)據(jù)中,MetCell 共識(shí)別出 3094 個(gè)單細(xì)胞事件,檢測(cè)到 5718 個(gè)代謝物離子峰,并通過(guò)多維匹配成功注釋 770 個(gè)代謝物。在多種常見(jiàn)細(xì)胞系中,MetCell 可檢測(cè) 5074–6975 個(gè)代謝物峰,并注釋 533–622 個(gè)代謝物,相比現(xiàn)有報(bào)道技術(shù),覆蓋度提升了 3–10 倍。尤為重要的是,MetCell 在多種細(xì)胞系中共鑒定并利用化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證了 389 個(gè) Level-1 代謝物,創(chuàng)造了迄今為止單細(xì)胞代謝組學(xué)研究中規(guī)模最大、注釋最準(zhǔn)確的記錄。

圖 2.單細(xì)胞代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理軟件MetCell與單細(xì)胞代謝物注釋結(jié)果
最后,研究團(tuán)隊(duì)利用該技術(shù)構(gòu)建了一個(gè)涵蓋 45,603 個(gè)衰老小鼠原代肝臟細(xì)胞的單細(xì)胞代謝圖譜。通過(guò)對(duì)原代肝細(xì)胞(hepatocytes)、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(liver sinusoidal endothelial cells,LSEC)、庫(kù)普弗細(xì)胞(Kupffer cells)及肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells, HSC)等四種常見(jiàn)肝組織細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞代謝組分析,團(tuán)隊(duì)建立了肝臟主要細(xì)胞類型的代謝物標(biāo)志物庫(kù),并在混合肝臟細(xì)胞樣本中實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞類型的準(zhǔn)確注釋。進(jìn)一步分析顯示,肝星狀細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的代謝異質(zhì)性:高視黃醇水平的肝星狀細(xì)胞伴隨視黃醛升高、谷胱甘肽及多不飽和脂肪酸磷脂下降,提示其承受更高的氧化應(yīng)激。衰老肝細(xì)胞的代謝變化也呈現(xiàn)異質(zhì)性特征。對(duì)圖譜中注釋的 25,370 個(gè)肝細(xì)胞進(jìn)行偽時(shí)間序列分析發(fā)現(xiàn),衰老肝細(xì)胞沿軌跡分布在兩個(gè)分支,分別富集甘油二酯和寡糖,提示肝細(xì)胞在衰老過(guò)程中可能分化為兩類功能不同的亞群:一類傾向于脂質(zhì)積累,另一類則傾向于糖原儲(chǔ)存。上述結(jié)論通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析與組織切片染色得到了驗(yàn)證。
綜上,該研究系統(tǒng)構(gòu)建了離子淌度質(zhì)譜流式單細(xì)胞代謝組學(xué)分析平臺(tái),并結(jié)合自主開(kāi)發(fā)的數(shù)據(jù)軟件 MetCell,實(shí)現(xiàn)了高通量、深覆蓋、超靈敏且代謝物準(zhǔn)確注釋的單細(xì)胞代謝組學(xué)分析。該技術(shù)可在單細(xì)胞層面檢測(cè)超過(guò) 5,000 個(gè)代謝物離子并注釋約 800 個(gè)代謝物,靈敏度達(dá)到阿摩爾級(jí)別,可準(zhǔn)確表征單細(xì)胞內(nèi)代謝物的動(dòng)態(tài)范圍?;谠摷夹g(shù),團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了涵蓋 45,603 個(gè)衰老小鼠肝臟細(xì)胞的單細(xì)胞代謝圖譜,實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞類型及亞型的精準(zhǔn)注釋,并揭示了肝細(xì)胞衰老過(guò)程中代謝變化的異質(zhì)性,為深入理解生命過(guò)程中的代謝多樣性提供了有力工具。
中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所生物與化學(xué)交叉研究中心博士后羅名都為論文的第一作者。朱正江研究員為論文的通訊作者。中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所生物與化學(xué)交叉研究中心為論文第一單位。中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所生物與化學(xué)交叉研究中心的胡軍浩研究員為該工作提供了寶貴的支持和幫助。該工作得到了國(guó)家自然科學(xué)基金委、中國(guó)科學(xué)院、上海市科委和上海尚思自然科學(xué)研究院等的資助。上述工作的相關(guān)技術(shù)已經(jīng)申請(qǐng)了國(guó)家發(fā)明專利與國(guó)家軟件著作權(quán),相關(guān)技術(shù)的商業(yè)用途需要聯(lián)系朱正江研究員進(jìn)行授權(quán)使用。
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