上海有機化學(xué)研究所在丹酚酸A生物活性作用機制和靶標(biāo)鑒定方面取得新進展
作為傳統(tǒng)中藥，丹參被廣泛使用已有數(shù)百年歷史。丹參酸A（SAA）是丹參主要的活性成分，具有心臟保護、抗氧化、抗炎和抗細(xì)胞增殖的活性。盡管研究SAA藥理活性的報道較多，但其藥理活性的分子機制及其作用靶標(biāo)仍不清楚。近年來，共價藥物逐漸興起。與非共價藥物相比，共價藥物表現(xiàn)出一些藥理學(xué)上的優(yōu)勢，如延長了持續(xù)作用時間并增強了功效，使用劑量更低，耐藥的可能性較小，以及可以靶向非成藥的蛋白質(zhì)。對共價藥物日益增長的興趣也激發(fā)了對共價化合物庫的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)。雖然天然產(chǎn)物可以成為易于獲得的共價配體來源，然而，將具有生物活性的天然產(chǎn)物開發(fā)成藥物仍然具有挑戰(zhàn)性，部分原因是受限于艱巨的靶點鑒定工作。
最近，中科院上海有機化學(xué)研究所小分子調(diào)控重點實驗室康經(jīng)武課題組采用化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)系統(tǒng)分析了SAA的蛋白質(zhì)靶標(biāo)譜，第一次從分子水平揭示了SAA抗腫瘤細(xì)胞增殖活性的作用機制。在他們先前的工作中（J Chromatogr A 2015，1388，267），采用毛細(xì)管電泳篩選技術(shù)發(fā)現(xiàn)SAA是一個很強的mTORC1復(fù)合體激酶抑制劑 (Ki = 100 nM)。mTORC1復(fù)合體是細(xì)胞響應(yīng)外界營養(yǎng)和生長激素刺激，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、代謝和維持穩(wěn)態(tài)平衡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中心。 激活的mTORC1通過磷酸化下游底物S6K激酶和4E-BP1促進細(xì)胞生長和增殖。mTORC1幾乎在所有腫瘤細(xì)胞中過度激活，因為被作為發(fā)現(xiàn)抗腫瘤藥物的靶標(biāo)。
從生化方法篩選得到的抑制劑是否在細(xì)胞內(nèi)作用相同的靶標(biāo)？這是目前被制藥界廣泛爭論的一個話題。為了得到答案，他們利用化學(xué)蛋白組學(xué)結(jié)合磷酸化蛋白組學(xué)對SAA的活性作用機理進行了系統(tǒng)研究。首先合成了炔基化SAA作為探針進行化學(xué)蛋白組學(xué)研究。 基于點擊化學(xué)的熒光成像分析發(fā)現(xiàn)SAA可以通過親電的α,β-不飽和羰基共價修飾細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。隨后的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)分析一共鑒定到46種高置信度的被SAA共價修飾的蛋白 (fold change>2.25, p<0.05)，其中包括mTORC1的一個亞基Raptor，這一亞基的作用是為mTORC1招募磷酸化底物。GO富集分析表明這些被SAA共價修飾的蛋白參與了細(xì)胞的氧化還原平衡，凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期、鈣平衡、神經(jīng)保護以及自噬調(diào)控等細(xì)胞過程。這表明SAA在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)出混雜的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，但是與mTORC1的作用依然明確。
蛋白磷酸化是一個十分重要的蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，細(xì)胞通過蛋白質(zhì)磷酸化來調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活性、定位和功能。考慮到mTORC1具有激酶的活性，他們用磷酸化蛋白組學(xué)分析了SAA對整個細(xì)胞信號通路的擾動情況。結(jié)果顯示SAA處理細(xì)胞后導(dǎo)致171 個蛋白的磷酸化水平顯著下調(diào)（fold change < -3, p value < 0.05），81個蛋白的磷酸化水平被顯著上調(diào)（fold change > 3, p value < 0.05）。KEGG分析表明這些磷酸化蛋白主要富集在調(diào)控細(xì)胞生長和增殖的PI3K-Akt-mTOR信號通路軸上。進一步的激酶底物富集分析（KSEA）也得到相同的結(jié)果。因此，從磷酸化蛋白組學(xué)層面上，可以證明SAA對mTORC1激酶活性的抑制作用非常明確。
他們進一步采用純化的mTORC1對結(jié)果進行生化驗證。將α,β-不飽和酯基加氫還原后，加氫還原產(chǎn)物對mTORC1的抑制活性衰減了1000倍，證明α,β-不飽和酯基結(jié)構(gòu)對于維持SAA的抗細(xì)胞增殖活性是必須的。用結(jié)構(gòu)類似物迷迭香酸進行活性比較，其活性比SAA活性低4倍，說明SAA與mTORC1結(jié)合是結(jié)構(gòu)特異性的。用高分辨質(zhì)譜可以確定SAA在Raptor上的結(jié)合位點發(fā)生在第65位的半胱氨酸殘基上，用Western blot 和細(xì)胞熱位移實驗CETSA驗證了細(xì)胞水平SAA對Raptor的共價結(jié)合。
總之，他們的工作第一次系統(tǒng)地在細(xì)胞水平上研究了SAA生物活性的分子機制，發(fā)現(xiàn)了mTORC1是SAA的作用的一個重要靶標(biāo)，并且是以共價修飾的方式。這一研究策略不僅揭示了丹酚酸A生物活性的作用機理，也為中藥活性成份研究提供了一種新技術(shù)和新思路。這一工作已在線發(fā)表在J Proteome Res（https://pubs.acs.org/articlesonrequest/AOR-FZJ9VDSAV4YW9NSIA5VF），第一作者為鄭蒙蒙博士，共一作為張艷梅博士。本工作得到上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院吳英理教授的幫助，得到國家自然科學(xué)基金和中國科學(xué)院戰(zhàn)略先導(dǎo)B計劃的支持。
圖 磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示了SAA處理NB4 細(xì)胞后對激酶活性的調(diào)節(jié)機制
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