近期，中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所生命有機(jī)化學(xué)國家重點實驗室劉文課題組首次闡明了利普斯他?。↙ipstatin）生物合成過程中碳骨架的形成機(jī)制（J. Am. Chem. Soc.2019, 141, 3993-4001）。
Lipstatin是從毒三素鏈霉菌（streptomyces toxytricini）發(fā)酵液中分離鑒定的天然產(chǎn)物，具有良好的抑制酯酶的活性。Lipstatin氫化的衍生物Orlistat（奧利司他）是目前FDA唯一批準(zhǔn)的治療肥胖癥的非處方藥物。雖然Lipstatin具有如此大的價值，但人們對它0的生物合成過程所知甚少。在前期報道的工作中，劉文課題組與上海交通大學(xué)陶美鳳課題組合作，確定了Lipstatin的生物合成由六個蛋白參與（依次編號為LstA-LstF），并從對應(yīng)蛋白敲除的突變株中分離鑒定了關(guān)鍵的中間產(chǎn)物（Appl. Environ. Microbiol. 2014, 80, 7473-7483）。他們發(fā)現(xiàn)敲除基因簇中兩個KAS-III同源蛋白LstA和LstB后，都未在其突變株中檢測到有價值的中間產(chǎn)物，說明LstA和LstB可能與Lipstatin的骨架合成相關(guān)。在保守催化三聯(lián)體Cys-His-Asn的作用下，典型的KAS-III通過脫除活性的羧基形成親核進(jìn)攻的烯醇式中間體來起始縮合反應(yīng)。雖然LstA和LstB同屬于KAS-III家族，但只有LstA具有保守的催化三聯(lián)體Cys-His-Asn，而LstB中對應(yīng)的氨基酸都發(fā)生了突變。此結(jié)果說明單獨的LstA就具備完整的縮合功能，而LstB在Lipstatin骨架合成中又扮演了怎樣的角色？
圖1 Lipstatin和Orlistat轉(zhuǎn)化關(guān)系以及Lipstatin的生物合成反分析。
此次工作中，他們通過體外酶學(xué)實驗確定了LstA，LstB和LstD在Lipstatin骨架形成中負(fù)責(zé)的功能。LstA和LstB以特殊的異源二聚體存在，并以非脫羧基式的Claisen縮合反應(yīng)，協(xié)同催化底物間縮合：LstA首先使用保守的半胱氨酸（Cys128α）掛載8碳底物，而用于親核進(jìn)攻的烯醇式中間體則經(jīng)LstB中保守的谷氨酸（Glu60β）催化形成；有趣的是，當(dāng)使用α,β不飽和雙鍵的8碳底物時，LstAB又催化了另外一種縮合機(jī)制，其中關(guān)鍵的烯醇式中間體由Glu60β引發(fā)1,4-Micheal加成反應(yīng)而形成?？s合的中間產(chǎn)物從Cys128α上水解后，再經(jīng)LstD催化還原，生成羧基更加穩(wěn)定的還原產(chǎn)物。他們還考察了LstAB對底物的容忍性，發(fā)現(xiàn)SNAC、苯硫酯類的模擬底物以及飽和脂肪鏈和一些雙鍵位移的類似物都能被LstAB接受。KAS-III和它所屬的硫解酶超家族蛋白多以同源二聚體的方式催化反應(yīng)。LstAB新穎催化機(jī)制的解析也讓人重新審視硫解酶超家族蛋白的功能機(jī)制。LstAB的同源蛋白廣泛地存在于鏈霉菌，諾卡氏菌和分枝桿菌等的菌屬中，而其負(fù)責(zé)合成化合物的結(jié)構(gòu)和功能仍待后續(xù)揭示。
圖2 異源二聚體 LstAB催化縮合機(jī)制
該工作主要由劉文課題組的張道忠博士完成，獲得了國家自然科學(xué)基金委，科技部，上海市科委和中科院等相關(guān)項目的資助。
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