Diels-Alder（D-A）反應(yīng)是一類能夠直接形成C-C鍵的重要有機(jī)反應(yīng)，可以高效地實(shí)現(xiàn)對(duì)于雜環(huán)、手性螺環(huán)和橋環(huán)等復(fù)雜結(jié)構(gòu)的構(gòu)筑，被廣泛地應(yīng)用于合成化學(xué)領(lǐng)域；近年來(lái)一些特殊的D-A反應(yīng)還被開(kāi)發(fā)為“點(diǎn)擊化學(xué)”（click chemistry）和“生物正交化學(xué)”（bioorthogonal chemistry），并應(yīng)用于材料科學(xué)和生命科學(xué)的研究中。通過(guò)對(duì)于天然產(chǎn)物生源合成途徑的分析，諸多天然產(chǎn)物的骨架構(gòu)筑過(guò)程中可能涉及到D-A反應(yīng)，因此D-A反應(yīng)也經(jīng)常被巧妙地應(yīng)用于天然產(chǎn)物的仿生合成研究中。一方面，隨著分子前線軌道理論的發(fā)展，合成化學(xué)家開(kāi)發(fā)了一系列能夠促進(jìn)D-A反應(yīng)的小分子催化劑；另一方面，基于著名化學(xué)家鮑林的酶催化理論（生物大分子在催化過(guò)程中可以通過(guò)主-客體相互作用穩(wěn)定底物小分子的反應(yīng)過(guò)渡態(tài)），人工篩選、制備的能夠識(shí)別底物反應(yīng)過(guò)渡態(tài)的抗體酶或核酶也能夠在一定程度上催化分子間的D-A反應(yīng)。然而，由于缺乏直接的結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物化學(xué)證據(jù)，天然產(chǎn)物的生物合成過(guò)程中所涉及到的D-A反應(yīng)是否由酶催化完成以及相應(yīng)的催化機(jī)制目前尚不為人知。近期，中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所生命有機(jī)化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室劉文研究員課題組與潘李鋒研究員課題組合作，在國(guó)際上首次報(bào)道了源于吡咯吲哚霉素（pyrroindomycin，PYR）生物合成途徑中的D-A酶PyrI4及其結(jié)合底物小分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，并綜合運(yùn)用生物化學(xué)、蛋白質(zhì)核磁共振等研究方法，系統(tǒng)性地闡明了以該蛋白為代表的酶促D-A反應(yīng)催化機(jī)理，相關(guān)成果發(fā)表于Cell子刊Cell Chemical Biology雜志上（Cell Chem. Biol., 2016, 23, 352-360.）。
PYR是一類來(lái)源于鏈霉菌（Streptomyces rugosporus）的螺環(huán)乙酰乙酸內(nèi)酰胺類抗生素，其對(duì)于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和耐萬(wàn)古霉素的腸球菌（VRE）均有較強(qiáng)的殺傷作用；另外該分子結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)[6,6]并環(huán)和一個(gè)[6,5]螺環(huán)，這樣兩個(gè)可能由酶促D-A反應(yīng)構(gòu)筑的結(jié)構(gòu)單元引起了合成化學(xué)家和生物化學(xué)家們極大的興趣。在前期的研究中，劉文課題組在國(guó)際上首次報(bào)道了PYR的生物合成基因簇（J. Am. Chem. Soc., 2012, 134, 17342-17345.），又通過(guò)體內(nèi)（in vivo）、體外（in vitro）實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，首次闡述了PYR分子母核的剛性五環(huán)骨架需要由連續(xù)兩步的酶促D-A反應(yīng)構(gòu)筑（Nat. Chem. Biol., 2015, 11, 259-265.），其中PyrI4催化了用于構(gòu)筑[6,5]螺環(huán)結(jié)構(gòu)的D-A反應(yīng)。
在本研究中，潘李鋒課題組與劉文課題組展開(kāi)合作，他們首先解析了PyrI4蛋白酶的晶體結(jié)構(gòu)（apo-型），發(fā)現(xiàn)其具備由β-桶狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成的剛性骨架；然后通過(guò)大量的條件篩選，他們又獲得了PyrI4結(jié)合底物小分子的過(guò)渡態(tài)的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)（holo-型），并基于結(jié)構(gòu)通過(guò)進(jìn)一步的生物化學(xué)研究闡明了該蛋白酶的催化活性空腔與重要氨基酸殘基；隨后，通過(guò)比較apo-型與holo-型蛋白結(jié)構(gòu)的差異并結(jié)合蛋白核磁共振分析，他們發(fā)現(xiàn)PyrI4蛋白N端的前22個(gè)氨基酸具有柔性很大的無(wú)序結(jié)構(gòu)，而當(dāng)?shù)孜锎嬖跁r(shí)，該部分序列會(huì)參與底物分子的識(shí)別，并通過(guò)與底物以及β-筒狀結(jié)構(gòu)之間的特異性相互作用，誘導(dǎo)其自身形成一個(gè)特殊的α-螺旋結(jié)構(gòu)，像“蓋子”一樣把底物分子擠壓到β-筒狀結(jié)構(gòu)的空腔中，這樣“蓋狀”結(jié)構(gòu)的形成能夠釋放大量的能量，由此將不利于反應(yīng)發(fā)生的“熵減效應(yīng)”轉(zhuǎn)化為利于反應(yīng)進(jìn)行的“焓效應(yīng)”。最后，根據(jù)一系列的生化實(shí)驗(yàn)和理論計(jì)算，他們最終提出PyrI4作為催化PYR[6,5]螺環(huán)結(jié)構(gòu)形成過(guò)程中D-A反應(yīng)的高效催化劑，主要發(fā)揮在如下幾個(gè)方面作用：①作為“熵陷阱”（entropy trap），有效地將長(zhǎng)鏈底物中二烯體和親二烯體兩部分結(jié)構(gòu)折疊成能夠有利于發(fā)生D-A反應(yīng)的構(gòu)象（即D-A反應(yīng)的過(guò)渡態(tài)構(gòu)象）；②活性位點(diǎn)處的Q115氨基酸殘基能夠通過(guò)與底物親雙烯體部分形成雙氫鍵，降低該部分的LUMO能量，從而促進(jìn)反應(yīng)的發(fā)生；③活性空腔中富含酸性氨基酸，酸性的空腔能夠?qū)崿F(xiàn)質(zhì)子轉(zhuǎn)移，防止pKa較低的酸性底物帶有負(fù)電荷；④由底物誘導(dǎo)的N端“蓋狀”結(jié)構(gòu)能夠通過(guò)在蛋白殘基之間形成大量氫鍵和鹽鍵而釋放能量，從而穩(wěn)定蛋白-小分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，并將原本對(duì)反應(yīng)不利的熵減效應(yīng)轉(zhuǎn)化為對(duì)反應(yīng)有利的焓效應(yīng)。
在此前的研究中，國(guó)際上僅有兩例[4+2]環(huán)加成酶的晶體結(jié)構(gòu)被報(bào)道，卻都因?yàn)槿狈Φ孜?蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)而未能闡明其催化機(jī)制；另外，這兩例報(bào)道也均存在較大的爭(zhēng)議。PyrI4蛋白結(jié)構(gòu)和功能的闡明，證實(shí)了自然界中存在天然的類似于人工抗體酶的催化機(jī)制：酶與底物結(jié)合放出能量后，兩者相互的構(gòu)象誘導(dǎo)使得小分子的構(gòu)象與D-A反應(yīng)過(guò)渡態(tài)的構(gòu)象極為相似，由此降低了活化能（Ea）并大大促進(jìn)了反應(yīng)的速率，而這一切正源于自然界中蛋白質(zhì)與小分子的共同進(jìn)化。通過(guò)與螺醇縮酮類天然產(chǎn)物生物合成途徑的對(duì)比，還可將此類“底物過(guò)渡態(tài)構(gòu)象折疊”酶的反應(yīng)機(jī)制推廣到更多的酶促協(xié)同反應(yīng)中（Curr.Opin. Chem. Biol., 2016, 31, 95-102.）。本研究為今后人工設(shè)計(jì)、開(kāi)發(fā)協(xié)同反應(yīng)的生物大分子催化劑提供了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和方向，并將在未來(lái)的合成化學(xué)和合成生物學(xué)研究中發(fā)揮重要的作用。
劉文課題組的博士生鄭慶飛和潘李鋒課題組的碩士生郭玉嬌為本文的共同第一作者。上述研究工作得到國(guó)家青年千人計(jì)劃項(xiàng)目、科技部973計(jì)劃青年專題項(xiàng)目、國(guó)家自然科學(xué)基金委面上項(xiàng)目、生命有機(jī)化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、科技部、上海市科委以及中國(guó)科學(xué)院的大力資助。
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