上海有機所揭示腦鈣化關鍵蛋白XPR1的活性調控機制
磷是維持人體生命活動的必需元素，在核酸構成、能量代謝、信號傳導及骨骼發(fā)育等生理過程中發(fā)揮關鍵作用。細胞內磷酸鹽的攝入對生命活動至關重要，但是過量的磷酸鹽積累會與鈣、鎂、鐵等離子沉積，帶來細胞和組織毒性，需要外排機制及時平衡。XPR1是目前人體唯一已知的磷酸鹽外排蛋白，其功能異常與腦鈣化、血栓形成、腫瘤發(fā)生等多種疾病密切相關。在原發(fā)性基底節(jié)腦鈣化癥中，XPR1功能失調導致磷酸鹽外排障礙，進而形成鈣磷沉積，最終誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)病變[1]。在細胞內XPR1的功能可被磷酸鹽濃度指示分子焦磷酸肌醇InsP8激活[2]。同時，支架蛋白KIDINS220能與XPR1形成復合物調控磷酸鹽的外排[3]。但是KIDINS220和InsP8調控XPR1功能的分子機制并不清晰，阻礙了我們對XPR1功能失調引起的腦鈣化等疾病發(fā)生機理的理解。
近日，中國科學院上海有機化學研究所生物與化學交叉研究中心、生命過程小分子調控國家重點實驗室張一小課題組，聯(lián)合澳大利亞國立大學Ben Corry課題組、上?？萍即髮W孫亞東課題組以及美國國立環(huán)境健康科學研究所Stephen Shears課題組，在Molecular Cell雜志上發(fā)表了題為“KIDINS220 and InsP8 safeguard the stepwise regulation of phosphate exporter XPR1”的研究文章。該研究通過結構解析、功能研究、計算模擬等手段揭示了XPR1一種精細的“key-to-locks”活性調控方式，以及一種獨特的“knock-kiss-kick”磷酸轉運外排機制，闡明了原發(fā)性腦鈣化相關突變的致病機理，并發(fā)現(xiàn)了磷酸外排同源蛋白XPR1、PXo、PHO1在進化上的保守性和差異性。
圖1. XPR1–KIDINS220復合物結構及InsP8激活XPR1的全構象變化過程
“Key-to-locks”活性調控方式：本研究通過冷凍電鏡解析了XPR1與神經(jīng)元支架蛋白KIDINS220復合物以及XPR1與InsP8復合物的高分辨三維結構，捕捉到XPR1激活過程中的多種功能狀態(tài)。結合功能實驗，本研究發(fā)現(xiàn)KIDINS220能將XPR1穩(wěn)定在關閉狀態(tài)，存在多重限制機制來給磷酸鹽外排活性上“鎖”。而天然底物InsP8，這一分子猶如“鑰匙”，能夠誘發(fā)XPR1的逐步激活：（1）在關閉狀態(tài)中，KIDINS220能夠與XPR1的不同基序結合，將XPR1的SPX結構域牢牢鎖定在非翻轉的關閉狀態(tài)。其中，XPR1的α1螺旋形成interaction hub來穩(wěn)定該構象。只有在InsP8存在并與XPR1的α1螺旋結合時，這一限制及其他內部約束才能被解除；（2） 在關閉狀態(tài)中，XPR1的C-loop形成“蓋子”，遮擋住胞內入口。InsP8誘導SPX結構域發(fā)生逐步構象重排，并發(fā)生180度的大翻轉。翻轉后的SPX暴露出與C-loop的結合界面，將胞內入口打開，從而解除第二重限制；（3）XPR1的TM9b螺旋控制著外側出口，當TM9b向外運動并擴大外側通道時，磷酸基團才能順利轉運至胞外（圖1）。綜上所述，XPR1的激活需要依次解除由KIDINS220、α1螺旋、C-loop和TM9b螺旋等形成的多重限制，從而實現(xiàn)孔道開放，這一“key-to-locks”機制揭示了XPR1活性的精細調控模式。
“Knock-kiss-kick”磷酸轉運外排機制：通過對電鏡數(shù)據(jù)的細致計算分析，研究人員發(fā)現(xiàn)XPR1胞內和胞外開口的開放是獨立的，捕捉到了磷酸鹽外排通道“關/關（內/外），開/關，關/開，開/開”四種不同的構象，這種互不耦聯(lián)的轉運模式與傳統(tǒng)的轉運蛋白完全不同。值得注意的是，在這四種構象下，在轉運通道內部均存在著一處非常狹窄的constriction site,即使是在“開/開”構象下，磷酸鹽也難以通過。結合磷酸基團的相互作用分析及分子動力學模擬，研究人員發(fā)現(xiàn)了磷酸鹽在通道內經(jīng)歷了一個獨特的外排過程：磷酸鹽首先通過靜電互斥，將constriction site附近的負電氨基酸向外推，將“門”敲開（knock），隨后在由多個帶正電氨基酸構成的磷酸結合口袋內短暫停留（kiss），附近帶負電及極性氨基酸平衡上述正電口袋的電性，削弱結合能力，口袋中結合的磷酸鹽短暫停留后被下一個進入口袋的磷酸鹽向外踢出（kick），最終完成轉運。基于此，本研究提出了一種新穎的“knock–kiss–kick”模型，用以描述XPR1介導的磷酸外排機制。
原發(fā)性家族性腦鈣化癥（PFBC）相關突變的致病機理：本研究不僅揭示了XPR1的正常調控機制，還為理解腦疾病提供了分子層面的解釋。PFBC患者中常見的致病突變（如R459C、R570L等）[1, 4]位于XPR1通道內的關鍵識別和門控區(qū)域。本研究解析了R459C、R570L這兩種突變體的結構，意外發(fā)現(xiàn)R459C呈現(xiàn)出類似于InsP8結合的激活態(tài)構象特征：SPX發(fā)生翻轉，胞內側入口開放；而R570L則穩(wěn)定于向外開放的構象。然而，這些突變雖然具有XPR1激活開放的構象特征，但是改變了通道內部的環(huán)境，使得磷酸鹽無法正常結合和轉運，顯著削弱了外排能力，最終導致鈣磷沉積。本研究為由XPR1功能失調引起的腦鈣化發(fā)病機制提供了直接的分子闡釋。
XPR1同源蛋白進化的保守性和差異性：XPR1的同源蛋白PHO1和PXo分別在植物和果蠅中發(fā)揮調節(jié)磷酸穩(wěn)態(tài)的重要作用。本研究通過結構解析發(fā)現(xiàn)，XPR1與PHO1、PXo在結構上高度相似，但也存在顯著差異： PXo始終保持外側開口開放，且InsP6或InsP8均無法使其SPX結構域穩(wěn)定，這提示PXo可能具有不同的激活調控機制。在解析PHO1結構時，本研究發(fā)現(xiàn)其兩個單體呈現(xiàn)不對稱分布，但這一特征與其功能之間的關系尚需進一步研究。這些結果提示，磷酸外排機制在不同物種中經(jīng)歷了保守與分化的雙重進化。
圖2.KIDINS220和InsP8調控XPR1磷酸鹽轉運活性的模型
總體來講，本研究完整描繪了XPR1的逐步激活過程，并提出了兩個新穎模型：“key-to-locks”揭示了InsP8如何解除KIDINS220及XPR1自身施加的多重抑制，“knock–kiss–kick”描述了磷酸鹽的外排過程（圖2）。這些發(fā)現(xiàn)不僅為理解人類磷酸鹽穩(wěn)態(tài)提供了分子基礎，也為腦鈣化、腫瘤等疾病的致病機理研究及潛在干預策略開辟了新方向。
中國科學院上海有機化學研究所生物與化學交叉研究中心博士研究生王曉捷、柏忠諫，澳大利亞國立大學博士研究生Ciara Wallis為共同第一作者。張一小研究員, Ben Corry教授, 孫亞東教授, Stephen Shears教授為本文通訊作者。第二軍醫(yī)大學楊田教授、杭州師范大學雷明光教授以及本文其他作者亦做出了重要貢獻。該工作得到了科技部科技創(chuàng)新2030-“腦科學與類腦研究”重大項目、國家自然科學基金海外優(yōu)青項目、中國科學院上海分院青年英才培育計劃，以及上海市科委的資助。
張一小研究員長期招聘細胞生物學、藥物化學、生物化學和結構生物學方向博士后和科研助理，歡迎申請 （yzhang@@@sioc.ac.cn）。
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.molcel.2025.08.003
參考文獻：
1. Lopez-Sanchez, U., et al., Characterization of XPR1/SLC53A1 variants located outside of the SPX domain in patients with primary familial brain calcification. Sci Rep, 2019. 9(1): p. 6776.
2. Li, X., et al., Control of XPR1-dependent cellular phosphate efflux by InsP(8) is an exemplar for functionally-exclusive inositol pyrophosphate signaling. Proc Natl Acad Sci U S A, 2020. 117(7): p. 3568–3574.
3. Bondeson, D.P., et al., Phosphate dysregulation via the XPR1-KIDINS220 protein complex is a therapeutic vulnerability in ovarian cancer. Nat Cancer, 2022. 3(6): p. 681–695.
4. Orimo, K., et al., A Japanese family with idiopathic basal ganglia calcification carrying a novel XPR1 variant. J Neurol Sci, 2023. 451: p. 120732.
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