2025年5月8日，生命過程小分子調(diào)控全國重點實驗室趙強團隊聯(lián)合中國科學(xué)院上海藥物研究所許葉春團隊在Nature Communications在線發(fā)表了題為 “Structure-based design of potent and selective inhibitors targeting RIPK3 for eliminating on-target toxicity in vitro”的研究論文。該研究針對RIPK3抑制劑普遍存在的“在靶凋亡毒性”問題，通過解析RIPK3突變體R69H逆轉(zhuǎn)凋亡的構(gòu)象調(diào)控機制，設(shè)計獲得高選擇性非凋亡型抑制劑，并首次揭示其靶向的全新結(jié)合位點。該成果為膿毒血癥、病毒性肺炎等炎癥性疾病的精準(zhǔn)治療提供了更安全的先導(dǎo)化合物，同時為激酶非催化功能的動態(tài)構(gòu)象調(diào)控開辟了新范式。
RIPK3抑制劑研發(fā)困境
RIPK3作為壞死性凋亡（necroptosis）信號通路的核心調(diào)控因子，通過兩種機制介導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡：在經(jīng)典路徑中，RIPK3依賴RIPK1介導(dǎo)的磷酸化激活，隨后激活下游MLKL，引發(fā)細(xì)胞膜破裂和炎癥因子釋放；而在某些病理狀態(tài)下（如甲型流感病毒引發(fā)的肺炎和SETDB1缺陷型壞死性結(jié)腸炎），RIPK3可繞過RIPK1，通過響應(yīng)ZBP1或TLR3/4信號獨立觸發(fā)壞死性凋亡，成為調(diào)控病毒感染與炎癥反應(yīng)的重要治療靶點。
然而，RIPK3抑制劑開發(fā)長期受限于“在靶凋亡毒性”——即多種骨架類型的RIPK3抑制劑在達到有效抗壞死劑量時，意外激活caspase-8依賴的凋亡通路，產(chǎn)生嚴(yán)重毒副作用。目前尚無普適有效的策略能夠系統(tǒng)性解決RIPK3抑制劑的“在靶凋亡毒性”問題，成為靶向RIPK3藥物研發(fā)的核心挑戰(zhàn)。
模擬R69H構(gòu)象的RIPK3抑制劑的理性設(shè)計及其全新作用模式解析
研究團隊以RIPK3 R69H突變體為突破口（該突變可逆轉(zhuǎn)GSK'872結(jié)合引起的凋亡毒性），通過解析RIPK3野生型及R69H突變體與GSK'872復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)R69H突變破壞二聚界面關(guān)鍵氫鍵，顯著削弱了激酶結(jié)構(gòu)域的二聚相互作用?；诖?，研究人員開展了基于結(jié)構(gòu)的理性抑制劑設(shè)計。結(jié)構(gòu)分析表明，R69H突變位于RIPK3激酶結(jié)構(gòu)域中αC螺旋鄰近區(qū)域，而GSK'872的噻唑環(huán)正好朝向該位置（圖1）。由此推測，在該區(qū)域引入疏水取代基有望擾亂αC螺旋構(gòu)象，進而影響R69側(cè)鏈的穩(wěn)定性，阻斷二聚化，從而模擬R69H構(gòu)象效應(yīng)?；谶@一推測，研究人員設(shè)計并合成了LK01001、LK01002、LK01003和LK01045等化合物，測試結(jié)果表明這些化合物展現(xiàn)出強效的RIPK3抑制能力，并在多種細(xì)胞模型中表現(xiàn)出優(yōu)異的抗壞死活性。更為重要的是，與GSK'872在5 μM時即可明顯激活caspase-3不同，這些化合物在高達50 μM濃度下亦未引發(fā)caspase-3活化，顯著擴大了安全窗口。
研究人員進一步解析了RIPK3與LK01003復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)LK01003所引入的環(huán)戊基誘導(dǎo)αC螺旋與DFG基序發(fā)生構(gòu)象變化，占據(jù)一個未被探索的疏水結(jié)合位點（圖2）。該構(gòu)象擾動同時影響R69側(cè)鏈的構(gòu)象，破壞其與周圍殘基之間的關(guān)鍵氫鍵網(wǎng)絡(luò)，進而抑制激酶結(jié)構(gòu)域的二聚過程，其構(gòu)象調(diào)控機制與R69H突變高度一致。此外，新位點的占據(jù)使得LK01003在379種激酶中展現(xiàn)出極高的選擇性。在1 μM濃度下，S(35)值低至0.005，顯著優(yōu)于GSK'872（圖2）。
占據(jù)全新結(jié)合位點規(guī)避“在靶凋亡毒性”策略的通用性驗證
為驗證策略的通用性，研究團隊對已知存在“在靶凋亡毒性”的RIPK3抑制劑PP2和Zharp-99進行結(jié)構(gòu)改造，通過引入疏水基團占據(jù)新位點，獲得兩類新型化合物。結(jié)果表明，新化合物不僅能夠有效抑制RIPK3激酶活性并阻斷壞死性凋亡，同時完全規(guī)避了“在靶凋亡毒性”。上述結(jié)果表明，該策略可作為規(guī)避“在靶凋亡毒性”的通用設(shè)計策略，為開發(fā)更安全且具高選擇性的RIPK3抑制劑提供了明確的結(jié)構(gòu)依據(jù)與理論支持。
上海藥物所蘇海霞研究員、杭州高等研究院博士后陳國峰、南京中醫(yī)藥大學(xué)/上海藥物所聯(lián)合培養(yǎng)博士生謝航、寧波諾丁漢大學(xué)/上海藥物所聯(lián)合培養(yǎng)博士生李宛宸為本文的共同第一作者。上海藥物所蘇海霞研究員、趙強研究員以及許葉春研究員為共同通訊作者。該項工作得到了上海同步輻射光源BL02U1、BL10U2、BL18U1線站及李敏軍博士的大力支持，獲得了國家重點研發(fā)計劃、中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項、原創(chuàng)新藥研究全國重點實驗室的資助。
全文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-025-59432-8.pdf
圖1：非凋亡型RIPK3抑制劑的設(shè)計、合成及活性評價
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圖2：非凋亡型RIPK3抑制劑的選擇性及其靶向新位點的作用模式解析
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