糖作為生命體系中三大聚合物分子之一，具有遠超核酸和蛋白的復雜結(jié)構(gòu)。實現(xiàn)高效的糖結(jié)構(gòu)鑒定和序列解析是開展糖類物質(zhì)活性與功能研究的基礎，是推動糖科學快速發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。前期工作中，中國科學院上海藥物研究所高召兵聯(lián)合攻關(guān)團隊利用基因工程改造后的生物納米孔描繪了糖官能團的電信號指紋圖譜，將納米孔在糖領域的研究從“糖檢測”正式推進至“糖測序”階段，納米孔糖測序（nanopore glycan sequencing）已成為研究熱點（J. Am. Chem. Soc.，2023，封面文章）。糖的結(jié)構(gòu)極其復雜，具備對復雜聚糖的綜合傳感能力是實現(xiàn)納米孔糖測序需要解決的前提之一，然而已有納米孔均不具備區(qū)分復雜聚糖的能力。
近期，上海藥物所高召兵/夏冰清（納米孔方向），生命過程小分子調(diào)控全國重點實驗室文留青（糖化學方向），程曦（計算生物學方向）等組成的聯(lián)合交叉攻關(guān)團隊，在前期的工作基礎上，設計并構(gòu)建了一種新型的工程化生物納米孔。利用該納米孔，攻關(guān)團隊取得了糖測序研發(fā)進程中的多項進展，第一，首次實現(xiàn)鏈長達到十糖的復雜聚糖電信號解析，并達到了單糖分辨率；第二，首次實現(xiàn)復雜聚糖分子異構(gòu)體的區(qū)分。特別值得指出的是，更長聚糖雖然因溶解度不佳未開展實驗，在無需借助額外適配體和機器學習分析的情況，該技術(shù)已可直接區(qū)分鏈長達到十糖的聚糖，顯示了該納米孔設計策略的優(yōu)勢。該工作是生物納米孔糖測序技術(shù)研發(fā)進程中又一節(jié)點性工作，相關(guān)內(nèi)容于2024年4月11日以“Direct Identification of Complex Glycans via a Highly Sensitive Engineered Nanopore”為題在線發(fā)表在Journal of the American Chemical Society上，并被選為封面文章。
圖1. JACS 封面（高靈敏度工程化納米孔直接區(qū)分復雜聚糖）
基于前期的工作基礎，為進一步優(yōu)化突變納米孔α -溶血素（M113R）的檢測靈敏度以及檢測窗口，攻關(guān)團隊對M113R進行新一輪的基因工程改造。在保留一級傳感位點M113R的基礎上，對多個二級位點進行了丙氨酸突變，這有利于在維持信號響應的同時，增大對糖分子鏈長或體積的檢測限。最終篩選獲得了一種在大尺寸復雜聚糖傳感中表現(xiàn)出較大潛力的工程化納米孔α -溶血素（M113R/T115A）。利用該突變納米孔，研究人員首先獲得只存在單糖差異的聚糖電信號，表征了聚糖中的單糖結(jié)構(gòu)差異，說明M113R/T115A納米孔對糖分子結(jié)構(gòu)具備單糖分辨率；其次，研究團隊利用M113R/T115A實現(xiàn)了從五糖到十糖的連續(xù)檢測，對其實現(xiàn)了顯著區(qū)分，首次將納米孔對于寡糖的實際讀長達到10（因溶解度限制目前僅測到10糖），為實現(xiàn)糖測序打下基礎；最后，利用該納米孔檢測了具有不同糖苷鍵的寡糖異構(gòu)體，實現(xiàn)了不同鏈長異構(gòu)體的區(qū)分，區(qū)分度達0.9，說明該納米孔可同時區(qū)分多種寡糖的結(jié)構(gòu)差異。進一步通過剖析納米孔-糖互作模式，闡明了納米孔高靈敏度鑒定復雜聚糖微小差異的分子機制。該團隊提供了一種實現(xiàn)復雜聚糖鏈長和結(jié)構(gòu)區(qū)分的納米孔設計范式，其單糖分辨率、鏈長讀取能力、異構(gòu)差異識別等為最終攻克納米孔糖測序發(fā)展過程中多個無法規(guī)避的難點提供重要借鑒。
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圖2. 納米孔M113R/T115A區(qū)分復雜聚糖?
聚糖的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性包括了種類豐富的單糖構(gòu)建模塊、多種形式的糖苷鍵、長短不一的鏈長和分支等，這給聚糖分析帶來了巨大的挑戰(zhàn)。近年來，研究人員在開發(fā)基于納米孔的聚糖鑒定方法方面做出了重大努力。這些工作為最終實現(xiàn)納米孔糖測序目標提供了寶貴的見解。但迄今為止，該領域仍處于初步階段。本研究設計的工程化納米孔提供了一種無適配體、高分辨率的方法，實現(xiàn)了對聚糖結(jié)構(gòu)的多方位識別，并在大尺寸、多官能團、極微差異的復雜聚糖識別上取得突破。
上海藥物所/上?？萍即髮W/臨港實驗室聯(lián)合培養(yǎng)博士生姚廣大，上海藥物所田銀平博士、博士生柯文軍、副研究員夏冰清為本文第一作者；上海藥物所/南京中醫(yī)藥大學聯(lián)合培養(yǎng)博士生方潔，上海藥物所博士后馬圣洲、研究員李鐵海為本文共同作者；上海藥物所高召兵研究員、生命過程小分子調(diào)控全國重點實驗室文留青研究員、夏冰清副研究員和程曦研究員為本文共同通訊作者。本研究工作得到了南京大學龍億濤教授和應佚倫教授的支持和幫助。本研究獲國家杰出青年基金、青促會創(chuàng)新基金、上海市糖專項、上海市科技創(chuàng)新行動計劃基金、上海市啟明星計劃、上海市自然科學基金、國家重點實驗室計劃等項目的支持。
全文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c02081?
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