機械力信號在生活中無處不在，參與介導多種感知覺的形成，比如手指觸摸書本產生觸覺，聲波傳遞到耳內引起震動產生聽覺。這些機械力信號的感知與傳導主要通過機械力敏感離子通道來完成。機械力信號能夠激活這些通道，從而允許離子通過，將機械力信號轉化為電化學信號，通過下游信號傳導介導多種重要的生理活動。OSCA/TMEM63家族是目前已知的最大的一類機械力敏感離子通道家族，在植物和動物界中均承擔著重要的生理功能，比如逆境響應、聽覺、渴覺及濕度感知等1-5。然而，由于在結構解析的過程中模擬機械力環(huán)境非常困難，OSCA/TMEM63家族蛋白的機械力激活的分子機制尚不明確，是機械力通道研究領域的一大技術難點。
2024年4月3日，中國科學院上海有機化學研究所生物與化學交叉研究中心、生命過程小分子調控全國重點實驗室張一小課題組聯(lián)合澳大利亞Vitor Chang心臟研究所Charles Cox課題組以及澳大利亞國立大學Ben Corry課題組在Nature上發(fā)表了題為Mechanical activation opens a lipid-lined pore in OSCA ion channels的文章。研究團隊通過將OSCA蛋白組裝到納米磷脂盤及脂質體中模擬機械力環(huán)境，捕捉到了OSCA蛋白激活態(tài)的三維構象，闡釋了其機械力激活的分子機制，并發(fā)現(xiàn)了一種全新的有磷脂排列的離子孔道組成形式（圖1），為機械力通道的研究提供了全新的范式，也為機械力感知異常相關藥物研發(fā)提供了理論和結構基礎。
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圖1. OSCA受機械力激活動態(tài)變化過程
本文的主要亮點包括：
1.通過多種不同的策略來捕捉OSCA蛋白激活態(tài)的三維構象；（圖2）
2. 利用納米磷脂盤發(fā)展了一種簡單易用的“l(fā)ipid titration”機械力模擬方法來進行“force-resolved” 的結構研究；
3. 實現(xiàn)了分子量小于200kDa的膜蛋白在脂質體中的高分辨三維結構解析；
4. 揭示了不同磷脂在OSCA機械力感知過程中的重要作用；
5. 發(fā)現(xiàn)細胞膜中的磷脂可以通過其headgroup形成“l(fā)ipid wall”來參與離子孔道的組成；
6. 對結構相似的TMC1及TMEM16家族蛋白的分子機制研究有很大的啟發(fā)。
在本文的研究中，作者首先嘗試將OSCA1.2蛋白組裝在納米磷脂盤中（nanodiscs，由膜支架蛋白圍成的磷脂雙分子層小圓盤）并使用β-環(huán)糊精抽提其中的脂質來引起剩余脂質的擴張，進而在蛋白周圍產生拉力環(huán)境。在冷凍電鏡的結構解析過程中，作者發(fā)現(xiàn)蛋白顆粒高度動態(tài)，雖然能夠觀察到與關閉狀態(tài)不同的構象變化，但是難以獲取清晰的高分辨率三維結構，推測是與環(huán)糊精從每個nanodisc中抽取出來的脂質含量不同有關。此時，作者猜想，?如果從一開始組裝nanodiscs的時候，就用不同量的磷脂來組裝，這樣更容易控制每個nanodisc中磷脂的含量，從而可能調節(jié)蛋白周圍拉力的大小。通過這種“l(fā)ipid titration”的方法，作者對蛋白構象變化進行了“滴定”，捕捉到了OSCA1.2單側激活的構象。但是在這個結構中，有兩根跨膜螺旋密度缺失，并且離子孔道面向細胞膜有很大的開口，因此無法確認離子通過路徑。接下來，作者通過電生理實驗驗證了曲率變化可以激活OSCA蛋白，而在之前的研究中，肖百龍教授團隊成功的用脂質體與蛋白之間的曲率錯配來捕捉Piezo1蛋白在激活態(tài)的三維結構，提示了脂質體可以用于其他機械力通道的研究6。但是OSCA蛋白總分子量只有175kDa，并且大部分包埋在細胞膜當中，給結構解析帶來了很大困難。作者通過樣品的優(yōu)化，成功將OSCA1.2組裝到大小較為均一的脂質體中，并在inside-in的取向中捕捉到了OSCA蛋白完全激活的高分辨三維結構。通過結構分析和電生理實驗，揭示了OSCA蛋白機械力感知的關鍵元件，以及發(fā)現(xiàn)二聚化對于穩(wěn)定OSCA蛋白的激活狀態(tài)十分重要?？墒窃诖碎_放構象中，雖然所有的跨膜螺旋都被清晰的解析，但離子孔道仍舊向細胞膜側有較大的開口。有意思的是，在電鏡密度圖中作者發(fā)現(xiàn)該開口剛好被一段由細胞膜磷脂組成的lipid wall所覆蓋。結合分子動力學模擬和電子密度特征，作者發(fā)現(xiàn)該lipid wall主要由磷脂的head group構成，而電生理實驗也發(fā)現(xiàn)改變head group的電性特征，會影響OSCA1.2的離子選擇性，進一步支持這一全新的“proteo-lipidic pore”。同時，作者還在OSCA3.1蛋白中發(fā)現(xiàn)了多個穩(wěn)定結合的lipids，結構研究和電生理實驗均發(fā)現(xiàn)通過突變移除一個interlocking lipid能夠引起OSCA3.1的自發(fā)開放，提示了磷脂在機械力感知過程中的重要作用。
圖2.?通過不同的策略捕捉OSCA蛋白激活態(tài)的三維構象并發(fā)現(xiàn)新的離子孔道組成形式
總的來說，本篇文章中作者通過多種策略模擬機械力環(huán)境，結合冷凍電鏡、電生理、分子動力學模擬等手段，首次揭示了OSCA/TMEM63家族蛋白在機械力激活狀態(tài)下一種全新的“蛋白-磷脂”離子孔道組成形式。由于OSCA/TMEM63家族蛋白與介導聽覺形成的TMC1機械力敏感通道及具有離子通道和脂質翻轉酶活性的TMEM16家族蛋白在結構上具有高度相似性，該研究也對這些結構相似家族蛋白的分子機制有很大的啟發(fā)。此外，該研究發(fā)展了新的基于nanodiscs的機械力環(huán)境模擬方法，同時擴展了小膜蛋白在脂質體中進行結構解析的可行性，為包括機械力通道在內的其他膜蛋白研究提供了新的思路。
中國科學院上海有機化學研究所生物與化學交叉研究中心博士研究生韓瑤瑤，澳大利亞Victor Chang心臟研究所博士后周子晶與澳大利亞國立大學博士后金瑞濤為本文共同第一作者。張一小研究員，Charles Cox教授與Ben Corry教授為本文共同通訊作者。上?？萍即髮W孫亞東研究員，浙江大學楊巍教授、岳曉敏研究員，上海有機所生物與化學交叉中心陳忠文研究員以及本文其他作者也對做出了重要貢獻。該工作得到了科技部科技創(chuàng)新2030-“腦科學與類腦研究”重大項目、國家自然科學基金海外優(yōu)青項目、中國科學院上海分院青年英才培育計劃、上海腦中心求索杰出青年項目及上海市科委的資助。
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原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41586-024-07256-9
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