上海有機(jī)所交叉中心與合作者解析首個(gè)Piezo復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)
Piezo家族離子通道感知機(jī)械力環(huán)境變化,將機(jī)械力信號轉(zhuǎn)化為下游電化學(xué)信號,介導(dǎo)多種重要的生理活動,包括觸覺、痛覺的感知,淋巴管發(fā)育,血壓調(diào)節(jié),神經(jīng)軸突再生等。其功能的異常會導(dǎo)致觸覺超敏痛、淋巴管發(fā)育不良、神經(jīng)退行性疾病等。Piezo2作為觸覺感受器的發(fā)現(xiàn)工作獲得了2021年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎,但是圍繞Piezo家族蛋白功能機(jī)制的研究,目前仍存在諸多未解之謎。比如Piezo蛋白自身能夠感知和傳遞機(jī)械力信號1-2,但是研究人員很早就已經(jīng)發(fā)現(xiàn),與異源表達(dá)的Piezo蛋白相比,在很多細(xì)胞系中內(nèi)源表達(dá)的Piezo表現(xiàn)出慢失活的門控特性(slow inactivation)3-5。但研究人員對這種門控特性差異產(chǎn)生的原因和生理意義并不清楚,推測與蛋白的相互作用或膜局部的磷脂組成等有關(guān)。由于許多離子通道都存在與之相結(jié)合的附屬亞基來調(diào)控其亞細(xì)胞定位和門控特性,長期以來研究人員也致力于尋找能夠調(diào)控Piezo蛋白功能的附屬亞基。附屬亞基的定義通常為(1)自身并不參與離子孔道形成 (2)與孔道蛋白有直接和穩(wěn)定的相互作用 (3)在異源表達(dá)系統(tǒng)中能夠調(diào)控通道特性 (4)在內(nèi)源細(xì)胞中能夠調(diào)控通道門控特性6。盡管研究人員做出了巨大的努力,目前還沒有發(fā)現(xiàn)能夠滿足以上四個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的Piezo附屬亞基,也阻礙了對Piezo蛋白不同門控特性分子機(jī)制的研究。
2023年8月18日,澳大利亞Victor Chang心臟研究所Charles Cox課題組與中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所生物與化學(xué)交叉研究中心張一小課題組在Science上發(fā)表了題為MyoD-family inhibitor proteins act as auxiliary subunits of Piezo channels(MyoD家族抑制蛋白作為Piezo通道的輔助亞基)的合作文章。首次報(bào)道了MyoD家族抑制蛋白MDFIC和MDFI是Piezo1/2的結(jié)合蛋白,作者通過結(jié)構(gòu)解析和功能研究,發(fā)現(xiàn)MDFIC通過C末端一段高度脂質(zhì)化修飾的兩親性α螺旋從側(cè)面插向Piezo的孔道模塊,并證實(shí)該α螺旋能夠引起外源和內(nèi)源Piezo1/2的慢失活過程。該研究鑒定了首個(gè)Piezo蛋白附屬亞基,解釋了在許多細(xì)胞類型中觀察到的內(nèi)源 Piezo 通道截然不同的門控特性,為Piezo通道功能機(jī)制的研究提供了全新的方向。

圖1.親和捕獲質(zhì)譜鑒定MDFIC是Piezo結(jié)合蛋白
在本文中,作者首先利用CRISPR/Cas9 編輯人真皮成纖維細(xì)胞 (hDF) 中的Piezo1 (在多種組織來源的成纖維細(xì)胞中Piezo1表現(xiàn)出較慢的失活特性), 通過三種不同的策略來鑒定Piezo1結(jié)合蛋白。通過嚴(yán)格的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析,確定三組中都存在但在各自的陰性對照中不存在的Piezo1相互作用蛋白。最終僅鑒定出兩種蛋白質(zhì),第一種是Piezo1,第二種是研究較少的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子MDFIC(圖1)。作者通過免疫共沉淀在HEK293T細(xì)胞中驗(yàn)證了MDFIC與Piezo1/2之間的相互作用。
圖2. Piezo1-MDFIC冷凍電鏡三維結(jié)構(gòu)
為進(jìn)一步探究MDFIC與Piezo的相互作用模式,研究人員利用冷凍電鏡單顆粒三維重構(gòu),解析了Piezo1-MDFIC 復(fù)合物的高分辨率三維結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)MDFIC通過C末端一段富含半胱氨酸的兩親性α螺旋從側(cè)面插向Piezo的孔道模塊。該α螺旋橫躺于磷脂雙分子層內(nèi)側(cè),與Piezo蛋白的多個(gè)氨基酸存在相互作用。在Piezo與MDFIC上均有能夠引起淋巴系統(tǒng)發(fā)育異常的突變位于該相互作用界面上,提示了Piezo-MDIFC復(fù)合物在功能上的重要性(圖2)。

圖3. MDFIC/MDFI調(diào)控Piezo蛋白的門控特性
由于MDFIC結(jié)合在Piezo的孔道模塊,作者推測MDFIC可能會調(diào)控Piezo的門控特性。通過全細(xì)胞膜片鉗,作者證實(shí)MDFIC和MDFI能夠顯著引起Piezo1/2通道的慢失活門控特性。有意思的是該門控特性是由與Piezo相互作用的最C末端的兩親性α螺旋所介導(dǎo),缺失該α螺旋的MDFIC則不能引起Piezo的慢失活。同時(shí)作者驗(yàn)證了該α螺旋對于內(nèi)源Piezo的慢失活同樣重要(圖3)。

圖4. MDFIC的脂質(zhì)化修飾參與Piezo門控調(diào)節(jié)
接下來,作者初步探究了MDIFC引起Piezo慢失活的分子機(jī)制。由于在Piezo1-MDFIC復(fù)合物冷凍電鏡密度中,位于細(xì)胞膜一側(cè)的5個(gè)半胱氨酸上均具有多余的密度,作者推測其為脂質(zhì)化修飾。通過?;锼亟粨Q實(shí)驗(yàn)作者證實(shí)MDFIC的C末端存在棕櫚?;?/font>修飾。接下來作者探究了MDFIC脂質(zhì)化修飾對Piezo門控特性的影響。將5個(gè)Cys突變?yōu)?/font>5個(gè)Ala或者5個(gè)Ser之后,缺少脂質(zhì)化修飾的MDFIC仍能夠與Piezo相結(jié)合,但是無法引起Piezo的慢失活,提示MDFIC的脂質(zhì)化修飾對于Piezo的門控特性有重要調(diào)節(jié)作用。通過分子動力學(xué)模擬,作者發(fā)現(xiàn)MDFIC上的脂質(zhì)化修飾能夠與在Piezo失活過程中起關(guān)鍵作用的L2475相互作用,可能介導(dǎo)了MDFIC對于Piezo蛋白的調(diào)控(圖4)。
綜上所述,本文鑒定了首個(gè)Piezo蛋白附屬亞基MDFIC,通過結(jié)構(gòu)解析和功能研究,揭示了MDFIC介導(dǎo)Piezo慢失活的分子機(jī)制。
澳大利亞Victor Chang心臟研究所博士后周子晶與中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所生物與化學(xué)交叉研究中心博士研究生馬曉諾為本文共同第一作者。Charles Cox教授與張一小研究員為本文共同通訊作者。澳大利亞國立大學(xué)的Ben Corry教授以及博士研究生Yie Chang Lin, 南方科技大學(xué)的姚明曦教授以及本文其他作者也做出了重要貢獻(xiàn)。該工作得到了科技部科技創(chuàng)新2030-“腦科學(xué)與類腦研究”重大項(xiàng)目、國家自然科學(xué)基金海外優(yōu)青項(xiàng)目、中科院上海分院青年英才培育計(jì)劃、上海腦中心求索杰出青年項(xiàng)目及上海市科委等項(xiàng)目的資助。
原文鏈接
參考文獻(xiàn)
1. B. Coste et al., Nature 483, 176–181 (2012).
2. R. Syeda et al., Cell Rep. 17, 1739–1746 (2016).
3. B. Coste et al., Science 330, 55–60 (2010).
4. S. Wang et al., Nat. Commun. 11, 2303 (2020).
5. D. Jakob et al., J. Mol. Cell. Cardiol. 158, 49–62 (2021).
6. D. Yan, S. Tomita, J. Physiol. 590, 21–31 (2012).