蛋白質(zhì)液-液相分離（liquid-liquid phase separation, LLPS）介導(dǎo)細(xì)胞中多種“無(wú)膜細(xì)胞器”（membrane-less organelles）的動(dòng)態(tài)組裝，無(wú)膜細(xì)胞器的形成參與到廣泛的生命過(guò)程中。近年來(lái)，越來(lái)越多具有不同生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)在體外具有LLPS能力。不同蛋白質(zhì)的LLPS對(duì)蛋白質(zhì)濃度、pH、離子強(qiáng)度、溫度、擁擠試劑等多種不同條件高度敏感。如何有效快速的在體外找到驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)LLPS的關(guān)鍵因素？以及如何系統(tǒng)的比較不同蛋白質(zhì)之間LLPS的能力？這些問(wèn)題尚未得到闡述。同時(shí)，蛋白質(zhì)處在細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的環(huán)境之中，系統(tǒng)研究翻譯后修飾，RNA, 分子伴侶，基因突變等胞內(nèi)因素如何影響及調(diào)控不同蛋白質(zhì)LLPS也顯得尤為重要。
2022年2月12日，中科院上海有機(jī)化學(xué)研究所生物與化學(xué)交叉中心劉聰課題組與上海交通大學(xué)Bio-X研究院李丹課題組合作在Cell Reports Physical Science上發(fā)表了題為“A high-throughput method for exploring the parameter space of protein liquid-liquid phase separation”的研究成果。該工作首先建立了基于自動(dòng)點(diǎn)樣機(jī)器人及高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)的高通量篩選及評(píng)估蛋白質(zhì)相分離能力的分析方法。該方法僅需少量蛋白質(zhì)樣品并擁有快速的篩選能力，能夠在體外高效地表征蛋白質(zhì)LLPS。進(jìn)一步，運(yùn)用建立的新方法篩選了近30種不同蛋白質(zhì)樣品，發(fā)現(xiàn)不同蛋白普遍具有不同程度的LLPS能力，首次提出蛋白質(zhì)相分離空間（LLPS space）這一全新概念來(lái)刻畫(huà)并比較蛋白LLPS的能力與性質(zhì)。進(jìn)一步，闡釋了蛋白質(zhì)LLPS的能力受蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、翻譯后修飾、基因突變以及分子伴侶的動(dòng)態(tài)調(diào)控。本工作為系統(tǒng)高效研究不同蛋白質(zhì)LLPS提供了有力的新方法，并為理解蛋白質(zhì)LLPS的性質(zhì)及動(dòng)態(tài)調(diào)控提供了新的視角。
在本工作中，研究者基于已有的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)整理并總結(jié)了誘導(dǎo)蛋白質(zhì)發(fā)生LLPS的不同條件，并建立了適用于體外篩選的96孔板篩選系統(tǒng)。通過(guò)自動(dòng)點(diǎn)樣機(jī)器人降低蛋白質(zhì)樣品的使用量，以及結(jié)合高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)快速拍攝方法，達(dá)到短時(shí)間高通量的鑒定不同條件下多個(gè)不同蛋白質(zhì)樣品的LLPS (圖1)。同時(shí)，對(duì)篩選結(jié)果進(jìn)行賦值（PPS score），并結(jié)合LLPS space來(lái)系統(tǒng)比較不同蛋白質(zhì)系統(tǒng)LLPS的能力。研究者首先通過(guò)對(duì)已知的相分離蛋白進(jìn)行篩選驗(yàn)證了96孔板篩選系統(tǒng)的實(shí)用性，接下來(lái)對(duì)近30個(gè)不同的蛋白質(zhì)樣品（RNA結(jié)合蛋白，淀粉樣蛋白，分子伴侶，蛋白酶等）進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)并鑒定了各個(gè)蛋白質(zhì)所具備的相分離條件，計(jì)算出不同蛋白的LLPS space，并揭示了蛋白質(zhì)相分離潛在的通用屬性（圖1）。
圖1 高通量蛋白質(zhì)相分離篩選方法的建立與運(yùn)用
研究者進(jìn)一步利用高通量的篩選方法對(duì)復(fù)雜系統(tǒng)的蛋白質(zhì)LLPS調(diào)控進(jìn)行探究。首先，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)之間的相互作用可以極大地降低多組分下蛋白質(zhì)相分離濃度的閾值，暗示了細(xì)胞中各蛋白質(zhì)在極低濃度下可通過(guò)相互作用驅(qū)動(dòng)無(wú)膜細(xì)胞器形成。其次，發(fā)現(xiàn)不同的分子伴侶能夠通過(guò)與底物蛋白相互作用從而正（負(fù)）調(diào)控蛋白系統(tǒng)的相分離能力和動(dòng)態(tài)屬性。最后，闡釋了特定位點(diǎn)翻譯后修飾或者遺傳突變對(duì)蛋白質(zhì)的LLPS具有重要的調(diào)控作用。綜上，本研究工作不僅有助于研究者快速探究特定蛋白質(zhì)相分離能力及其調(diào)控機(jī)制，同時(shí)還有助于我們更加全面系統(tǒng)地認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)相分離在復(fù)雜生命過(guò)程中的作用（圖2）。
圖2 不同蛋白質(zhì)液-液相分離空間（LLPS space）的表征與動(dòng)態(tài)調(diào)控
上述工作由中科院上海有機(jī)所生物與化學(xué)交叉研究中心劉聰研究員和上海交通大學(xué)李丹特別研究員為共同通訊作者，李丹課題組博士研究生李懿臣和劉聰課題組博士谷錦閣為共同第一作者。經(jīng)費(fèi)支持主要來(lái)自中國(guó)科學(xué)院，國(guó)家自然科學(xué)基金委，以及上海市科委的資助。
