
低分子肝素鈉精細(xì)結(jié)構(gòu)分析取得新進(jìn)展
近日,Analytical Chemistry 雜志發(fā)表了康經(jīng)武課題組在低分子量肝素(LMWHs)精細(xì)結(jié)構(gòu)分析方面的研究成果(Anal. Chem. 2013, 85, 1819?1827)。作為一類抗凝血藥物,LMWHs在臨床上用于治療肺栓塞、腦栓塞及手術(shù)后預(yù)防血栓的形成。在此類藥物中,依諾肝素鈉(Enoxaparin sodium)是全球銷量前20位的藥物,年銷售額在30-40億美元。2010年美國FDA 通過法案,批準(zhǔn)依諾肝素鈉仿制藥物上市,但要求從結(jié)構(gòu)上證明仿制藥物與原產(chǎn)家藥物具有生物一致性(Biosimilar)。因此,低分子肝素精細(xì)結(jié)構(gòu)的分析方法很快成為學(xué)術(shù)界和制藥界關(guān)注的焦點(diǎn)。此外,隨著肝素越來越多的生物活性(如抗腫瘤活性)被發(fā)現(xiàn),需要強(qiáng)有力的分析方法用于結(jié)構(gòu)與生物活性關(guān)系的研究。
肝素是由L-艾杜糖醛酸(或葡糖醛酸)和N-乙酰葡糖胺(或D-葡糖胺)形成的二糖單元重復(fù)構(gòu)成的高度硫酸化的線性多糖。肝素經(jīng)過酶或化學(xué)的方式部分降解就可以獲得LMWHs。高度的結(jié)構(gòu)非均一性,加上裂解時(shí)出現(xiàn)的衍生物,使得LMWHs精細(xì)結(jié)構(gòu)的分析異常困難。
在這篇論文中,他們提出一種能夠?qū)崿F(xiàn)全面分析LMWHs精細(xì)結(jié)構(gòu)的新策略。用超高效體積排阻色譜/飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPSEC/Q-TOF-MS)對(duì)完整的糖鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行Top-down (自上而下)的表譜分析(profiling)。UPSEC可以將LMWHs中的所有糖鏈成份按分子量大小分為24個(gè)餾分,通過在線連接的Q-TOF-MS可以獲得每一餾分中各異構(gòu)體的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)。這樣的分析方法不僅可以獲得糖鏈鏈長(zhǎng)分布數(shù)據(jù),也大大簡(jiǎn)化了質(zhì)譜圖的復(fù)雜程度,有助于質(zhì)譜數(shù)據(jù)的解析。通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)的卷積分析法可以獲得糖鏈的building blocks(構(gòu)建模塊)組成、糖鏈的硫酸化和氨基乙?;潭鹊?,一共鑒定出包括1,6-成環(huán)結(jié)構(gòu)、非還原端為飽和艾杜糖醛酸,以及糖鏈數(shù)為奇數(shù)的70多種寡糖鏈結(jié)構(gòu)。隨后他們對(duì)構(gòu)成糖鏈的building blocks進(jìn)行bottom-up(從下而上)式的定量分析。定量分析糖鏈需要用三種肝素酶混合物徹底水解低分子肝素,然后用建立的毛細(xì)管電泳方法對(duì)10個(gè)二糖,1個(gè)三糖,2個(gè)四糖,特別重要的是4個(gè)帶有1,6-成環(huán)結(jié)構(gòu)的寡糖衍生物進(jìn)行分離測(cè)定。為了保證定量分析的準(zhǔn)確性,他們依據(jù)硫酸化寡糖的電泳淌度與其電荷-質(zhì)量比呈線性關(guān)系的原理,提出一種對(duì)無法獲得標(biāo)準(zhǔn)品的特殊硫酸化寡糖的定性分析方法。
兩種分析方法分別提供了互補(bǔ)的結(jié)構(gòu)信息,綜合兩種方法獲得的數(shù)據(jù),就可以獲得完整的低分子肝素的結(jié)構(gòu)全貌。
這一研究成果為低分子肝素類藥物的質(zhì)量控制以及肝素結(jié)構(gòu)與生物活性關(guān)系研究提供了關(guān)鍵技術(shù)。該方法已經(jīng)申請(qǐng)PCT專利并在某制藥公司得到實(shí)施,成為“創(chuàng)新驅(qū)動(dòng),轉(zhuǎn)型發(fā)展”的范例。
上述研究工作得到國家自然科學(xué)基金委、科技部和中國科學(xué)院的大力資助。
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